Los nematodos parásitos causan importantes pérdidas económicas en el ganado a nivel mundial. Cooperia oncophora es uno de los parásitos con gran cantidad de reportes vinculados a resistencia de fármacos en el mundo. El sistema WMicrotracker, se implementó para establecer un ensayo de motilidad práctico, automatizado y de bajo costo, en el parásito Cooperia oncophora en estadio xL3. Para el testeo, se seleccionó una biblioteca de reposicionamiento de 2745 moléculas, con el fin de hallar drogas existentes para nuevas terapias. Catorce antihelmínticos ya conocidos resultaron encontrados en esta búsqueda, sin embargo, se identificaron cuatro nuevas drogas: bromuro de tonzonio, NH125, sulfato de fisostigmina y EVP4593.
Materiales y Métodos
Los ensayos a ciego de antihelmínticos, se realizaron en microplacas estériles de 96 pocillos fondo plano. En la microplaca, se añadió un µl de la solución madre de cada compuesto de la biblioteca (10 mM en DMSO) a 99 µl de RPMI-1640 y se dispuso por duplicado. Las larvas en estadio xL3 de C.oncophora recolectadas en RPMI-1640 se ajustaron a 800 larvas / ml. Luego, se transfirieron 80 xL3s en 100 μL de RPMI-1640 a cada pocillo. La concentración final del compuesto a testear fue de 50 µM en el solvente DMSO al 0,5% (v / v). Se utilizó DMSO al 0,5% (cuatro repeticiones) como control de solvente, y como control positivo se utilizó levamisol 50μM (cuatro repeticiones). La placa se agitó (300 rpm / min) durante 10 min y se incubó a 37ºC en una incubadora humidificada con una atmósfera de CO2 al 5% durante 8 h. Luego, se pipetearon suavemente los pocillos hacia arriba y hacia abajo 5 veces para estimular los gusanos. La placa se colocó en el equipo WMicrotracker y se dejaron los parásitos habituando durante 5 minutos en la cámara (oscura) del WMicrotracker, seguido de un monitoreo de incubación y motilidad durante 3 horas a 20ºC. Se utilizó un ciclo de luz /oscuridad (1 h / 1 h) en el WMicrotracker como estímulo durante la medición. La actividad locomotora se registró cada 30 minutos. El porcentaje del movimiento promedio durante las 3 horas de exposición a los compuestos versus el control DMSO, se utilizó para estimar la actividad antihelmíntica relativa.
Resultados
De los 2735 compuestos presentes en la biblioteca de drogas, 18 redujeron la motilidad de los gusanos en ≥ 70%, resultando en potenciales drogas antihelmínticas. Después de conocer sus estructuras (hasta ese momento, el ensayo fue ciego), 14 resultaron ser antihelmínticos conocidos y no se consideraron para estudios adicionales. Los otros cuatro compuestos no se conocían como agentes antihelmínticos (Fig. 1): bromuro de tonzonio, NH125, sulfato de fisostigmina y EVP4593. Se determinaron sus valores de EC50 y la droga EVP4593 mostró la actividad más potente (Tabla 1). La selección de una biblioteca de compuestos de reposicionamiento/reutilización condujo a cuatro éxitos nuevos. Uno de estos (EVP4593) demostró propiedades prometedoras como un antihelmíntico.
Vet Parasitol. 2019 Jan;265:15-18. doi: 10.1016/j.vetpar.2018.11.014. Epub 2018 Dec 7.
Maoxuan Liu, Bart Landuyt, Hugo Klaassen, Peter Geldhof, Walter Luyten