Debido al alto costo y la larga duración de los métodos de prueba tradicionales para la neurotoxicidad del desarrollo (DNT), solo se ha evaluado la actividad de DNT de una pequeña fracción de las sustancias químicas a las que están expuestos los seres humanos. En este trabajo, se diseñó un ensayo novedoso para DNT que mide tanto el tiempo de desarrollo como los niveles de actividad en las larvas de C. elegans, la prueba de desarrollo y actividad del gusano (wDAT). El desarrollo larvario de C. elegans progresa a través de cuatro estadios que pueden identificarse por el tamaño y la morfología de las larvas. Entre cada una de estos estadios, el gusano en desarrollo entra en un breve período de letargo donde muda la cutícula. Por lo tanto, la evaluación automatizada de los niveles de actividad e inactividad permiten mapear el progreso del desarrollo de C. elegans a través de las cuatro etapas larvarias y hasta la edad adulta. Los cambios en la altura máxima de la actividad de wDAT en relación con el control indicarían niveles de actividad motora alterados específicos del estadio. Si los compuestos DNT que inducen hiperactividad en mamíferos también inducen aumentos de altura de pico en C. elegans, esto indicaría concordancia para la respuesta de hiperactividad. Para una evaluación inicial de la capacidad de la wDAT para detectar neurotoxinas del desarrollo de mamíferos, se seleccionaron tres metales pesados, el arsenito de sodio (NaAs), el acetato de plomo (PbOAc) y el acetato de mercurio (HgOAc), asociados con la hiperactividad en el desarrollo en mamíferos. Se seleccionó acetato de litio (LiOAc) como control de toxina del desarrollo que no está asociada con la hiperactividad en los mamíferos.
Se prepararon gusanos sincronizados sin alimento en estadio larvario (L1) que fueron recolectados mediante centrifugación 20 ± 1 h después de la obtención de huevos. Se preparo una suspensión de gusanos a aproximadamente 1 gusano por ul en CeHM y se transfirieron 900 ul por pocillo en microplacas de 12 wells. A continuación, se añadieron a los pocillos 100 µl de agua o del compuesto a testear en concentración 10x en agua, con tres réplicas por condición en cada placa de 12 pocillos. Después de agitar suavemente para asegurar la mezcla, las placas se colocaron en el equipo WMT dentro de una incubadora humidificada a 20ºC y se monitorearon durante 3 días. Para la evaluación se utilizó la actividad media de los tres pocillos de réplica técnica en un tiempo de 30 minutos.
El WMT resulto capaz de detectar la motilidad en larvas pequeñas, aunque la sensibilidad de detección aumentaba a medida que crecían los gusanos, como lo indica el aumento de la altura de los picos a medida que los gusanos desarrollaban a través de cada etapa larvaria (L1-L4) y hasta la edad adulta (Fig. 3A). Los valles entre cada pico indican el momento de cada período de letargo entre las etapas larvarias (Fig. 3A). Se seleccionó el valor de intervalo más alto en cada pico para representar el nivel de actividad para ese estadio para cada condición. Además, se utilizó el tiempo del valor de intervalo más alto para representar el tiempo del estadio. La actividad y el tiempo de desarrollo de L3 y L4 se utilizaron para la evaluación de la toxicidad. Se planteó la hipótesis de que el momento y los niveles máximos de actividad de wDAT podrían usarse para detectar tanto el retraso en el desarrollo como la neurotoxicidad del desarrollo. Se detectaron retrasos significativos en el desarrollo de C.elegans para LiOAc, NaAs, PbOAc y HgOAc a 150, 50, 5 y 2 μg / mL respectivamente. Como resultado del ensayo de crecimiento larvario basado en COPAS y el wDAT, la toxicidad del desarrollo se clasificó como HgOAc> PbOAc> NaAs> LiOAc; La técnica wDAT detectó retrasos significativos a concentraciones más bajas, lo que indica que el wDAT es más sensible para la detección de retraso del desarrollo que el método de crecimiento larvario basado en COPAS. Se detectaron niveles significativos de hiperactividad en L3 y / o L4 con NaAs, PbOAc y HgOAc a 100, 10 y 3 μg / mL, respectivamente, correspondientes a hallazgos de hiperactividad en mamíferos expuestos a estos metales pesados. La exposición temprana al litio se asocia con retraso en el desarrollo, pero no con hiperactividad en mamíferos, y no se detectó hiperactividad para LiOAc en C. elegans con el wDAT. Un solo instrumento WMT cuesta menos del 5% del costo de un COPAS, lo que hace que el WMT sea accesible incluso para laboratorios más pequeños.
Food Chem Toxicol. 2018 Nov;121:583-592. doi: 10.1016/j.fct.2018.09.061. Epub 2018 Sep 25.
Piper Hunt, Nicholas Olejnik, Keenan Bailey, Cory Vaught, Robert Sprando.