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Los receptores de hormonas nucleares (NHR, por sus siglas en inglés) están emergiendo como blancos candidatos contra la infección y la resistencia a los nematodos. Sin embargo, existe una falta de información exhaustiva sobre los genes que codifican NHR en nematodos parasitarios. En este estudio, curamos la familia de genes nhr para 60 nematodos parasitarios importantes de humanos y animales. Utilizando una plataforma de ARN de interferencia de alto rendimiento, eliminamos la expresión de 43 genes nhr de H. contortus e identificamos al menos dos genes que son necesarios para la viabilidad (es decir, nhr-105) y el desarrollo (es decir, nhr-17) de las larvas infectantes de este nematodo parasitario in vitro. Aprovechar este atlas funcional preliminar de los genes nhr para H. contortus impulsará los estudios biológicos de esta familia de genes en la genética de nematodos, la infección y el metabolismo de antihelmínticos dentro de los animales hospedadores, así como el prometedor descubrimiento de nuevos objetivos de intervención.
Materiales y Métodos
RNAi: Se utilizó un método de inmersión para el ensayo de eliminación de genes mediado por ARN pequeños de interferencia (siRNA) en H. contortus (Khan et al., 2020). Los siRNAs dirigidos a genes nhr específicos se diseñaron utilizando el BLOCK-iT™ RNAi Designer (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) y se verificaron por especificidad mediante la búsqueda BLASTN contra conjuntos de genes de H. contortus. El siRNA específico de genes se sintetizó y se empaquetó con una formulación de lípidos catiónicos Lipofectamine RNAi MAX reagent (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El siRNA empaquetado (200 pM) se añadió al DMEM que contenía xL3s de H. contortus, 10% de suero de oveja y 1× antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), y se incubó durante 24, 48 o 72 h, a 38 ºC y 10% v/v de CO2. Se utilizó qRT-PCR para el análisis de la eliminación de genes en larvas tratadas con RNAi, como se describió anteriormente.
Ensayo de motilidad: La motilidad de las larvas tratadas con RNAi y no tratadas se midió utilizando un método establecido (Herath et al., 2022; Taki et al., 2021). En resumen, se dispensaron xL3s de H. contortus en placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 300 gusanos por pocillo, y se incubaron en DMEM (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) que contenía 10% de suero de oveja, 1× antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), siRNAs empaquetados en lipofectamina dirigidos a genes nhr específicos (prueba) o el mismo volumen de DMEM (control) durante 48 h a 38 ºC y 10% v/v de CO2. La motilidad larval de los grupos de prueba y control (se incluyeron cuatro réplicas en cada grupo) se midió utilizando el sistema WMicrotracker ONE (Phylumtech, Argentina), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se calcularon las proporciones de muerte de las larvas tratadas y no tratadas con RNAi después de 72 h de incubación. La motilidad y la proporción de muerte de las larvas tratadas con RNAi se calcularon y normalizaron con respecto a las larvas no tratadas.
Resultados
La interferencia de ARN en todo el genoma indica dos genes nhr cruciales para la viabilidad y el desarrollo larval. Evaluamos genes nhr que son importantes para la viabilidad y el desarrollo larval, sumergiendo las xL3s de H. contortus con siRNA específico dirigido a ciertos genes nhr in vitro. Se detectó la eliminación de genes mediada por RNAi para 43 genes nhr en este nematodo parasitario (P ≤ 0.05; Fig. 4A), resultando en fenotipos de motilidad disminuida (por ejemplo, nhr-105, nhr-119 y nhr-173) o desarrollo larval (por ejemplo, nhr-17, nhr-25.2 y nhr-121). En particular, en comparación con las larvas no tratadas, el RNAi (nhr-105) resultó en una disminución del 60% de la motilidad larval después de 24 h de tratamiento in vitro (Fig. 4B), mientras que el RNAi (nhr-17) resultó en un compromiso del 55% de la proporción de desarrollo de xL3s a L4s in vitro después de siete días de tratamiento (Fig. 4C). Ni la disminución marcada de la motilidad larval ni el desarrollo larval significativamente comprometido fueron resultado de la muerte del gusano (Fig. 2 suplementaria). En comparación con el control negativo, los niveles de transcripción de varios genes nhr se incrementaron significativamente después de la inmersión con siRNA específico. Estos genes nhr incluyen nhr-14 (P ≤ 0.001), nhr-43 (P ≤ 0.05), fax-1 (P ≤ 0.05), unc-55 (P ≤ 0.001) y HCON_00107920 (P ≤ 0.01) (Fig. 4A). Sin embargo, no se encontraron cambios fenotípicos obvios en términos de viabilidad o desarrollo larval.
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Usando el gusano H. contortus como modelo de nematodo gastrointestinal, demostramos que algunos genes nhr responden al suero del hospedador y/o al tratamiento antihelmíntico, incluyendo nhr-64 que podría estar involucrado en la respuesta al estrés antihelmíntico, nhr-105 que fue demostrado como importante en la motilidad larval, y nhr-17 que fue necesario para el desarrollo larval. Estos hallazgos novedosos proporcionan moléculas clave involucradas en la resistencia a los medicamentos y candidatos objetivos para el descubrimiento de fármacos.
Infection, Genetics and Evolution, Volumen 122, 2024, https://doi.org/10.1016/j.meegid.2024.105609
Zhendong Du, Danni Tong, Xueqiu Chen, Fei Wu, Shengjun Jiang, Jingju Zhang, Yi Yang, Rui Wang, Sambuu Gantuya, Tserennyam Davaajargal, Sukhbaatar Lkhagvatseren, Zayat Batsukh, Aifang Du, Guangxu Ma