Los sarcómeros musculares contienen polipéptidos gigantes compuestos de múltiples dominios de inmunoglobulina y fibronectina y uno o dos dominios de proteína quinasa. Varios miembros de la familia de quinasas podrían ser pseudokinasas con poca o ninguna actividad. En este trabajo se evalúa la actividad catalítica, empleando el modelo de proteína twitchin (UNC-22) del invertebrado Caenorhabditis elegans. En experimentos in vitro, el cambio de una lisina conservada dio como resultado la eliminación de la actividad quinasa sin afectar a la estructura general del dominio. La misma mutación, unc-22 (sf21), se generó en el gen endógeno de C.elegans. Sin embargo, los gusanos unc-22 (sf21) presentaron sarcómeros bien organizados. Para caracterizar al mutante unc-22 (sf21), se realizó un ensayo de sensibilidad a nicotina. Los mutantes unc-22 conocidos, como por ejemplo unc-22 (e105), se contraen y son resistentes a la nicotina.
Materiales y Métodos
El ensayo de nicotina se realizó con animales jóvenes adultos sincronizados para cada genotipo (unc-22 (e105), unc-22 (sf21) y la cepa salvaje) en medio M9. Después de un lavado final con solución M9, conteniendo 0,01% de Triton X-100 (M9T), se preparó una suspensión de gusanos. Para los ensayos, se usaron placas de 96 pocillos conteniendo ~50-100 gusanos / pocillo en un volumen final de 50 ul de M9T. La placa se colocó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se midió la actividad locomotora en condiciones sin nicotina durante 1 hora usando el sistema WMicrotracker. Después de la medición, se añadieron 50 μl de M9T conteniendo una solución de nicotina al 0,2 o al 0,1% a cada pocillo, y se volvió a registrar la actividad locomotora. Para cada cepa y concentración de nicotina, se analizaron ocho pocillos independientes. En los gráficos de la actividad locomotora versus tiempo, cada punto representa la media y el error estándar.
Resultados
En presencia de nicotina, los animales unc-22 (sf21) no se contraen y muestran una respuesta de tipo salvaje a la nicotina (Figura Suplementaria S3). Ensayos complementarios, mediante transferencia de Western, muestran que el mutante unc-22 (sf21) expresa niveles normales de diversas isoformas de la proteína twitchin de tamaño apropiado. Mediante inmunotinción, también se observó que el mutante unc-22 (sf21) presenta una estructura de sarcómero normal en sus células musculares de la pared del cuerpo.
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Mol Biol Cell. 2017 Jun 15;28(12):1591-1600. doi: 10.1091/mbc.E16-10-0707. Epub 2017 Apr 20.
Matsunaga Y, Hwang H, Franke B, Williams R, Penley M, Qadota H, Yi H, Morran LT, Lu H, Mayans O Benian GM