Tetradenia (T.) riparia (Hochst.) Codd (Lamiaceae), también conocida como Iboza riparia (Hochst.) N.E.Br., es una de las plantas medicinales más frecuentemente utilizadas en la medicina ruandesa tradicional. Fue utilizada como un remedio contra diversas enfermedades, incluyendo malaria, angina, pian, absceso dental, dolor de cabeza, infecciones con gusanos y varios tipos de fiebres y dolencias.
A pesar de sus diversas aplicaciones como antihelmíntico, aún se desconocen cuáles serían los compuestos activos presentes en Tetradenia riparia responsables de esta actividad. Recientemente, se ha demostrado que las hojas de T. riparia poseen una importante actividad antihelmíntica contra Caenorrhabitis elegans (C. elegans). En este estudio, un bioensayo de fraccionamiento utilizando al modelo C.elegans permitió el aislamiento del compuesto activo.
Materiales Y Métodos
El ensayo antihelmíntico se llevó a cabo en una microplaca de 96 pocillos fondo plano. Larvas de C.elegans en estadio joven adulto se resuspendieron en solución M9 a una concentración de 3000 larvas/ml. A continuación, se añadieron 15 μl de esta suspensión (aproximadamente 45 larvas) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos conteniendo 184 μl de un cultivo de E. coli OP50 (DO = 0,5). Posteriormente, se añadió 1 μL de extracto de planta, fracción o solución de compuesto puro a cada pocillo; la concentración de partida en la microplaca fue de 1000 μg/ml para los extractos totales y de 100 μg/ml para las fracciones, y como control del solvente se utilizó DMSO (1 μL) en un pocillo separado. Después de homogeneizar, la placa se colocó en el sistema de registro WMicrotracker y se incubó durante 16 horas a 20°C. La actividad locomotora de los gusanos, se registró cada 30 minutos. El porcentaje del movimiento promedio durante 16 horas (excepto la primera hora) de las muestras testeadas con extracto, fue comparado con el control DMSO, para estimar la actividad antihelmíntica relativa. El levamisol (concentración final 50 μM) se utilizó como control positivo. Los datos de los experimentos de dosis-respuesta se representaron como el porcentaje de inhibición y se analizaron con el software GraphPad Prism 6 (San Diego, CA). Se utilizó el ajuste no lineal Alog (inhibidor) frente a la respuesta para estimar la CI50.
Resultados
El bioensayo de fraccionamiento demostró que solo el extracto de hexano presentaba actividad, luego de la extracción líquido/líquido de la fracción de hexano (hexano y diclorometano) y la cromatografía en columna de la fracción de diclorometano sobre gel de sílice para el aislamiento del principio activo antihelmíntico, es decir, 8 (14), 15-sandaracopimaradiene-7α, 18-diol de las hojas de Tetradenia riparia. La actividad antihelmíntica de este diterpenediol explica el uso de T. riparia contra parásitos en la medicina tradicional ruandesa. El valor del IC50 en el ensayo de C.elegans fue de 5.4 ± 0.9 μg/ml (17.8 ± 2.9 μM). Recientemente se ha descrito la actividad nematicida de un extracto de acetato de etilo de Tetradenia riparia (Okem et al., 2012), con una concentración letal mínima en C.elegans de 0.004 mg/ml. Aunque, en el trabajo de Okem et al., no se han identificado los compuestos bioactivos, la potencia de este extracto resulta comparable con el compuesto purificado mediante el fraccionamiento, lo que sugiere que el extracto informado contenía principalmente el compuesto que identificamos, o que su potencia estaba incrementada por la presencia de compuestos sinérgicos.