Puesta a punto de un ensayo rápido para mediciones de toxicología en pez cebra

Puesta a punto de un ensayo rápido para mediciones de toxicología en pez cebra

15 febrero, 2018

El pez cebra (Danio rerio) se emplea cada vez más para evaluaciones de toxicidad y descubrimiento de fármacos. Los enfoques experimentales para la evaluación de la biotoxicidad se basan en la inspección visual o la grabación de videos. Sin embargo, estas técnicas son limitas para los ensayos a gran escala, ya que requieren un uso intensivo de recursos informáticos para analizar una gran cantidad de capturas de pantalla. Recientemente, hemos desarrollado una metodología simple para el seguimiento de la actividad locomotora de pequeños animales cultivados en placas de microtitulación. En este trabajo, implementamos esta metodología automática, basada en la dispersión de micro-haces infrarrojos (IR), para medir la actividad de larvas del pez cebra. Se determinaron las condiciones de cultivo apropiadas, el número de animales y la etapa de desarrollo adecuado para la obtención de resultados robustos. Además, se validó la metodología como una prueba rápida para medir toxicidad, utilizando compuestos de referencia (CuSO4 , K2CrO4, 2,4-dinitrofenol, 3,4-dicloroanilina, benzoato de sodio, DMSO, SDS, EDTA y etanol).

Materiales y Métodos:

Para el ensayo se colocaron tres embriones de pez cebra aún no eclosionados (48 hpf) por

pocillo de una placa de 96 pocillos, conteniendo 225 ul de medio E3 y se incubó por 48 h adicionales a 28ºC. Se agregaron para completar a un volumen final de 250 ul, 25 ul de la solución con los compuestos 10 veces concentrada o con medio E3 (control). Para cada ensayo, se utilizaron ocho réplicas técnicas para cada dilución. La actividad se registró durante 15 min a las 4, 24 y 48 h después de la adición de los compuestos ensayados a temperatura ambiente. Inmediatamente después, se verificaron las placas mediante inspección manual en un microscopio estereoscópico, para validar el recuento de actividades. Los experimentos fueron iniciados entre 3 y 5 horas después de que se encendió la iluminación ambiental (ZT3 a ZT5).

Resultados:

El orden de toxicidad de los compuestos medidos fue CuSO4> 2,4-dinitrofenol> 3,4-dicloroanilina> SDS> benzoato de sodio>EDTA> K2CrO4; Con respecto a los solventes, EtOH ≈DMSO (Tabla 1 y Figura 2). Se estimó la concentración que podría causar una disminución del 50% en los valores de actividad (AEC50), mostrando una correlación lineal fuerte Q1 (R2 = 0.91) con los valores LC50 obtenidos con la prueba estándar DarT (Figura 3).En este estudio, se ha demostrado que el comportamiento natatorio global podría utilizarse como una lectura sencilla de toxicidad. Este enfoque es potencialmente aplicable para los ensayos de ecotoxicidad y para la búsqueda masiva de compuestos en experimentos automatizados, lo que reduce el tiempo y el dinero necesarios para evaluar muestras desconocidas e identificar los principales compuestos farmacéuticos.